Busqueda de farmacos centrada en IECA

INTRODUCCIÓN A LA BÚSQUEDA DE FÁRMACOS.

La búsqueda de nuevos fármacos es un campo amplio e interesante por la multitud de opciones posibles en relación con las propiedades, mecanismos de acción, de obtención, etc. que se presentan a la hora de buscar un nuevo fármaco.

Nosotros nos centraremos dentro de todo este maremagnum en la búsqueda de nuevos inhibidores. Antes de comenzar con los inhibidores concretos que hemos investigados hablaremos un poco de cómo se buscan los nuevos fármacos y qué es un inhibidor.

Etapas de desarrollo de un fármaco.

· Investigación básica.

1- Búsqueda de Prototipos o “Cabezas de serie”: un compuesto químico que posee una actividad biológica nueva.

2- Optimización del prototipo.

· Desarrollo preclínico.

1. Producción a gran escala.

2. Estudio del perfil farmacológico.

3. Estudio del perfil toxicológico.

4. Estudio del perfil ADME (Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción)

· Desarrollo clínico.

Fase I. Administración en seres humanos, estudios de tolerancia en individuos sanos.

Fase II. Determinación de dosis y pautas de tratamientos.

Fase III. Perfil de eficacia y seguridad en comparación con fármacos conocidos.

Fase IV. Estudios de postcomercialización

Este es un esquema general del proceso. En nuestro caso nosotros nos detenemos en la parte de búsqueda de prototipos. Esta búsqueda se puede hacer de muchas formas. En nuestra empresa afrontamos dos formas distintas de hacerlo.

A partir de extractos vegetales sometidos a pruebas en presencia de la enzima que se quiere inhibir (la ACE en nuestro caso).

A partir de una biblioteca de compuestos diseñados mediante síntesis teórica basados en la estructura del centro activo que se quiere inhibir o en la estructura de otros inhibidores (la Elastasa en el caso de nuestros compañeros).

¿Qué es un inhibidor enzimático?

Un inhibidor enzimático es un fármaco que bloquea o reduce la acción de una enzima implicada en un proceso biológico. Estos inhibidores pueden actuar de dos formas distintas:

1. Evitando que se forme un metabolito.
2. Evitando que un sustrato necesario se metabolice.

Dentro del primer grupo existen muchos inhibidores. La enzima puede inhibir de forma reversible (inhibidor competitivo) o de forma irreversible (enlace covalente con la enzima, inactivación). Para el segundo caso se actúa más sobre el sustrato para evitar que la enzima pueda transformarlo.

Pueden ser:

· Quimioterápicos: los que se usan frente a microorganismos o parásitos con enzimas no presentes o muy modificadas en los organismos superiores.

· Farmacodinámicos: inhibir enzimas del organismo superior para modular una función biológica que presente alguna patología.

Introducción.

La enzima convertidora de la angiotensina o ECA (ACE en sus siglas inglesas) es una dicarbopeptidasa que contiene Zn⁺² en su estructura. La ECA es producida por varios tejidos corporales tan diversos como el sistema nervioso central, riñones y pulmón.

Esta enzima actúa sobre el sistema renina-angiotensina-aldosterona el cual regula la hemodinámica cardiovascular y el balance de electrolitos en los líquidos corporales.

La renina plasmática convierte el angiotensinógeno en angiotensina I, que no tiene ningún tipo de actividad fisiológica. En las paredes internas de los vasos sanguíneos (endotelio) encontrados en órganos (corazón, pulmón, riñón, vasos sanguíneos, células de músculo liso) y en el plasma, la angiotensina I es convertida posteriormente en su forma activa que se ha dado a llamar angiotensina II. Este paso es gobernado por la enzima convertidora de angiotensina (ECA).

El mecanismo de acción de este segundo paso es el siguiente:

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu (angiotensina I)

¯ ACE

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe + His-Leu (angiotensina II)

Asp-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg (bradiquinina)

¯ ACE

Asp-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro + Phe-Arg

¯ ACE

Asp-Pro-Pro-Gly-Phe + Ser-Pro

Esta enzima se encuentra ligada a membrana o circulando en distintos fluidos corporales. La angiotensina II es un potente agente vasoconstrictor lo que provoca que se eleve la resistencia vascular periférica y, por ende aumentar la tensión arterial. Actúa de forma específica sobre las arteriolas, aunque tiene acción también sobre las vénulas. En las glándulas suprarrenales, la angiotensina II estimula la secreción de la hormona aldosterona, que trabaja a nivel renal produciendo una reabsorción de sodio y agua, promoviendo la excreción de potasio lo que provoca aumento de la presión arterial. Posteriormente, la angiotensina II sufre una degradación a angiotensina III por acción de enzimas de nombre angiotensinasas.

Nosotros buscamos, entonces, nuevos fármacos inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina que permitan un mejor tratamiento de la hipertensión. Además de inhibir la enzima propiamente dicha, se puede inhibir el receptor de Angiotensina II.

Búsqueda de Inhibidores a partir de extractos de origen biológico.

Nuestro trabajo consiste en partir de los extractos de origen biológicos recibidos por la empresa desde distintos lugares del planeta. Estos extractos se someten a tests en los que se determina su actividad o inactividad como inhibidores de la ECA.

Lo que haremos será preparar en microplacas de 96 una serie de ensayos en los que tendremos en presencia de la ECA los distintos extractos. Junto con el blanco, un control negativo y algún inhibidor conocido podremos determinar si en un extracto en concreto existe actividad inhibidora o no.

Si hay actividad, se seleccionará el extracto y este se enviará al grupo de químicos quienes se encargarán de tratar el extracto para extraer de él los distintos compuestos que lo formen. Luego cada uno de esos compuestos se someterá a un tratamiento igual al anterior para determinar, finalmente, cual de ellos es el que posee esa actividad inhibidora.

Método y Reactivos.

Para realizar este estudio de empleará un sustrato, el FAPGG (furilacriloilfenilalanilglicilglicina, en presencia de la Enzima Convertidora de la Angiotensina (ECA) que produce la reacción de hidrólisis del péptido de la siguiente manera:

FAPGG ® (encima de la flecha ACE) FAP + GG

Este proceso produce, a 340 nm, un descenso en la absorbancia directamente proporcional a la actividad de la ECA. Por tanto, tenemos que realizar un estudio basado en el método cinético y empleando un detector ultravioleta para placas.Vamos a utilizar un kit para medir actividad de ACE de la empresa Sigma-Aldrich que nos proporciona la mezcla de sustrato y tampones necesarios para llevar a cabo el ensayo.

El kit nos proporciona 10 tubos a disolver en 10 mililitros. Nosotros vamos a disolverlo en 5 mililitros para disponer de un volumen mayor con el que podamos jugar para la cantidad de enzima y extracto. Además, así tenemos doblemente concentrado el sustrato.

Enzima.

Antes de realizar el ensayo debemos determinar el rango de concentración óptimo de la enzima para el ensayo. Este rango será aquel en el que no se encuentre el sistema saturado. Para ello se mide la variación de la absorbancia por minuto y se representa frente a la concentración de enzima. La zona de la gráfica que sea una línea recta determinará ese rango.

Placa.

En una placa de 96 pocillos con un volumen de 250 ml emplearemos 200 y en los pocillos echaremos, haciendo duplicados de cada uno, los siguientes volúmenes dependiendo de si es el blanco, el control negativo, el inhibidor conocido, o los distintos extractos de los que disponemos.

Para el blanco: 100 ml del Kit (tampón más sustrato) + 100 ml de agua.

Para el control negativo: 100 ml del Kit + 50 ml de la enzima + 50 ml de agua.

Para el inhibidor conocido: 100 ml del Kit + 50 ml de la enzima + 50 ml de captopril

(Empleamos por ejemplo este inhibidor conocido, pero podríamos emplear otro cualquiera como: lisinopril, enalapril, etc.)

Para cada extracto: 100 ml del Kit + 50 ml de la enzima + 50 ml del extracto.

Rellenamos la placa con todos los compuestos que tengamos (por duplicado) y si hacen falta más se disponen otras placas de la misma forma. Estas placas se meten en el detector ultravioleta y se establece una medida continua durante 5 minutos de la absorbancia y se piden las gráficas de todos los pocillos. Se representará absorbancia con respecto al tiempo.

Costes.

Como toda empresa, antes de realizar el ensayo hemos tenido que presentar un presupuesto que debía ser aprobado por nuestros inmediatos superiores en el laboratorio. A continuación se detallan los precios de todos los reactivos empleados:

Kit Sigma-Aldrich: 672,92 €

Enzima Convertidora de Angiotensina (conejo): 291,70€/unidad

Captopril (Capoten): 0,00416€/mg